Biotechnology: Principles and Processes

आधुनिक जैव प्रौद्योगिकी के दो प्रमुख मूल सिद्धांत हैं:

1. आनुवंशिक इंजीनियरिंग (Genetic Engineering): ऐसी तकनीकें जिनके द्वारा आनुवंशिक पदार्थ (DNA एवं RNA) के रसायन में परिवर्तन करके इसे पोषी जीवों में प्रविष्ट कराया जाता है और इसके फलस्वरूप पोषी के लक्षणप्ररूप (Phenotype) में वांछित परिवर्तन लाया जाता है। पुनर्योगज डीएनए (rDNA) का निर्माण, जीन क्लोनिंग तथा जीन स्थानांतरण इसके तीन मूलभूत चरण हैं।
2. जैव प्रक्रम इंजीनियरिंग (Bioprocess Engineering): संदूषण-रहित (रोगाणु-मुक्त / विसंक्रमित) वातावरण बनाए रखकर केवल वांछित सूक्ष्मजीवों या यूकेरियोटिक कोशिकाओं की भारी मात्रा में वृद्धि कराना, जिससे प्रतिजैविकों, टीकों, एंजाइमों आदि का औद्योगिक पैमाने पर उत्पादन संभव हो सके।

प्रथम पुनर्योगज डीएनए का निर्माण (1972):

स्टेनली कोहेन (Stanley Cohen) तथा हर्बर्ट बोयर (Herbert Boyer) ने 1972 में प्रथम पुनर्योगज डीएनए बनाया:

• उन्होंने जीवाणु Salmonella typhimurium के प्राकृतिक प्लाज्मिड से 'प्रतिजैविक-प्रतिरोधी जीन' (Antibiotic resistance gene) को प्रतिबंधन एंजाइम (आणविक कैंची) द्वारा काटकर अलग किया।
• इस पृथक किए गए जीन को एक संवाहक प्लाज्मिड (Vector DNA) के साथ एंजाइम डीएनए लाइगेज (DNA Ligase) की सहायता से जोड़ दिया। इससे एक नया संकर डीएनए बना जिसे पुनर्योगज डीएनए (Recombinant DNA) कहते हैं।
• जब इस पुनर्योगज डीएनए को Escherichia coli (E. coli) जीवाणु में स्थानांतरित किया गया, तो डीएनए पॉलीमरेज की सहायता से इसकी अनेक समान प्रतियां बन गईं। इसे जीन क्लोनिंग (Gene Cloning) कहते हैं।

पुनर्योगज डीएनए तकनीक हेतु चार प्रमुख आणविक साधनों की आवश्यकता होती है:

1. प्रतिबंधन एंजाइम (Restriction Enzymes - आणविक कैंचियां):

ये न्यूक्लिएज एंजाइम समूह के सदस्य हैं। 1963 में E. coli में जीवाणुभोजी की वृद्धि को रोकने वाले दो एंजाइम खोजे गए—एक जो डीएनए में मिथाइल समूह जोड़ता था, तथा दूसरा जो डीएनए को काटता था। डीएनए को काटने वाले एंजाइम को 'प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज' कहा गया।

• प्रथम प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज: Hind II था (स्मिथ, नाथन्स एवं आर्बर द्वारा पृथक)। यह डीएनए को 6 क्षारक युग्मों के एक विशिष्ट अनुक्रम पर काटता है। आज 900 से अधिक प्रतिबंधन एंजाइम 230 से अधिक जीवाणु प्रभेदों से पृथक किए जा चुके हैं।
• नामकरण का नियम:
  • प्रथम अक्षर जीवाणु के वंश (Genus) से लिया जाता है (राजधानी अक्षर, जैसे Escherichia से 'E')।
  • अगले दो अक्षर जीवाणु की जाति (Species) से लिए जाते हैं (जैसे coli से 'co')।
  • चौथा अक्षर प्रभेद (Strain) को दर्शाता है (जैसे RY 13 प्रभेद से 'R')।
  • अंत में रोमन अंक उस जीवाणु से उस एंजाइम के पृथक्करण के क्रम को दर्शाता है (उदा. EcoRI)।
• पैलिंड्रोमिक डीएनए अनुक्रम (Palindromic Sequences): प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज डीएनए में विशिष्ट पैलिंड्रोम को पहचानते हैं। पैलिंड्रोम अक्षरों का वह समूह है जो दोनों दिशाओं (आगे और पीछे) से पढ़ने पर एक समान पढ़ा जाता है (जैसे 'MALAYALAM')। डीएनए में पैलिंड्रोम क्षारक युग्मों का वह क्रम है जो दोनों रज्जुकों पर समान ध्रुवता ($5' \rightarrow 3'$ अथवा $3' \rightarrow 5'$) में पढ़ने पर एक जैसा होता है।
  EcoRI का पैलिंड्रोम अनुक्रम:
  $$5' - \text{G } \downarrow \text{ A A T T C} - 3'$$
  $$3' - \text{C T T A A } \uparrow \text{ G} - 5'$$
• चिपचिपे सिरे (Sticky Ends): EcoRI पैलिंड्रोमिक स्थल के केंद्र से थोड़ी दूर, किंतु दोनों रज्जुकों में समान दो क्षारकों (G और A) के बीच कट लगाता है। इसके परिणामस्वरूप सिरों पर एकल रज्जुक का छोटा फैला हुआ भाग रह जाता है जिसे चिपचिपे सिरे (Sticky ends) कहते हैं। ये सिरे अपने पूरक क्षारकों के साथ आसानी से हाइड्रोजन बंध बना लेते हैं, जिससे डीएनए लाइगेज द्वारा इनका जुड़ना अत्यधिक सुगम हो जाता है।

2. क्लोनिंग संवाहक (Cloning Vectors):

संवाहक (Vectors) वे डीएनए अणु होते हैं जो विजातीय डीएनए (विदेशी जीन) को पोषी कोशिका में ले जाकर उसकी क्लोनिंग कराते हैं। प्लाज्मिड एवं जीवाणुभोजी सर्वोत्तम संवाहक हैं।

एक प्रारूपिक क्लोनिंग संवाहक (pBR322) की प्रमुख विशेषताएं:

• 1. प्रतिकृतियन की उत्पत्ति (Ori - Origin of Replication): यह वह विशिष्ट डीएनए अनुक्रम है जहाँ से प्रतिकृतियन प्रारंभ होता है। कोई भी विजातीय डीएनए जब इससे जुड़ता है तो पोषी कोशिका के भीतर प्रतिकृति कर सकता है। Ori संवाहक से जुड़े डीएनए की प्रतियों की संख्या (Copy number) का भी नियंत्रण करता है।
• 2. वरणयोग्य चिह्नक (Selectable Marker): यह अपुनर्योगजों (Non-transformants) की पहचान कर उन्हें नष्ट करता है और केवल पुनर्योगज (Transformants) कोशिकाओं की वृद्धि की अनुमति देता है। उदा. E. coli में एम्पीसिलीन प्रतिरोधी जीन ($amp^R$) तथा टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधी जीन ($tet^R$) अत्यंत उपयोगी वरणयोग्य चिह्नक हैं।
• 3. क्लोनिंग स्थल (Cloning Sites): संवाहक में किसी प्रतिबंधन एंजाइम का केवल एकल (Unique) पहचान स्थल होना चाहिए। एक से अधिक स्थल होने पर संवाहक के कई टुकड़े हो जाएंगे। pBR322 में $amp^R$ भाग में Pst I, Pvu I स्थल हैं तथा $tet^R$ भाग में BamH I, Sal I स्थल हैं।
• 4. निवेसी निष्क्रियता (Insertional Inactivation): जब विजातीय डीएनए को किसी प्रतिरोधी जीन (जैसे $tet^R$ के BamH I स्थल) में जोड़ा जाता है, तो टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधकता समाप्त (निष्क्रिय) हो जाती है। अतः पुनर्योगज एम्पीसिलीन माध्यम में तो उगते हैं किंतु टेट्रासाइक्लिन माध्यम में मर जाते हैं।
  नीले-सफेद कालोनियों का चयन (Blue-White Screening): प्रतिजैविक प्लेटिंग की जटिलता से बचने हेतु विजातीय जीन को $\beta$-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम के जीन में प्रविष्ट कराया जाता है। अपुनर्योगज जीवाणु क्रियाधार (X-gal) पर नीले रंग की कालोनियां बनाते हैं; जबकि पुनर्योगज जीवाणुओं में जीन के निष्क्रिय होने से रंगहीन/सफेद कालोनियां बनती हैं जिन्हें आसानी से पहचान लिया जाता है।
• पादपों एवं जंतुओं में जीन क्लोनिंग संवाहक:
  • पादपों में: Agrobacterium tumefaciens (मृदा जीवाणु) को 'पादपों का प्राकृतिक आनुवंशिक इंजीनियर' कहा जाता है। इसका ट्यूमर-प्रेरक Ti-प्लाज्मिड (Tumor-inducing plasmid) अहानिकर (Disarmed) बनाकर द्विबीजपत्री पौधों में मनचाहे जीन स्थानांतरित करने हेतु प्रयुक्त होता है।
  • जंतुओं में: हानिकारक पश्चविषाणुओं (Retroviruses) को रोगजनकता-रहित (Disarmed) बनाकर जंतु कोशिकाओं में उपयोगी जीन पहुंचाने हेतु संवाहक के रूप में प्रयोग किया जाता है।

डीएनए एक जल-स्नेही (Hydrophilic) अणु है, अतः यह कोशिका झिल्ली (फॉस्फोलिपिड लिपिड-द्विपरत) के आर-पार स्वतः नहीं जा सकता। पोषी जीवाणु को डीएनए ग्रहण करने हेतु सक्षम (Competent) बनाना अनिवार्य है:

1. रासायनिक विधि (सक्षम कोशिका निर्माण):

जीवाणु कोशिकाओं को एक विशिष्ट सांद्रता वाले द्विसंयोजी धनायन जैसे कैल्शियम ($Ca^{2+}$) से उपचारित किया जाता है। कैल्शियम आयन जीवाणु भित्ति के छिद्रों से डीएनए के प्रवेश की दक्षता बढ़ाते हैं। इसके बाद कोशिकाओं को पहले बर्फ पर (Ice), फिर क्षणिक रूप से $42^\circ\text{C}$ पर (ऊष्मा आघात / Heat Shock), और पुनः बर्फ पर रखा जाता है। इस तापीय आघात से पुनर्योगज डीएनए जीवाणु के भीतर प्रविष्ट हो जाता है।

2. प्रत्यक्ष / संवाहक-मुक्त जीन स्थानांतरण (Direct Gene Transfer Methods):

• सूक्ष्म अंतःक्षेपण (Micro-injection): इसमें एक अत्यंत सूक्ष्म कांच की सुई (माइक्रोपिपेट) द्वारा पुनर्योगज डीएनए को सीधे जंतु कोशिका के केंद्रक के भीतर अंतःक्षेपित कर दिया जाता है।
• जीन गन अथवा बायोलिस्टिक्स (Biolistics / Gene Gun): यह पादप कोशिकाओं हेतु विशेष रूप से उपयुक्त विधि है। इसमें स्वर्ण (Gold) अथवा टंगस्टन (Tungsten) की सूक्ष्म गोलियों (Micro-particles, व्यास 1-2 $\mu m$) पर डीएनए का लेप करके उन्हें उच्च वेग से पादप कोशिकाओं पर बमबारी (दागा) की जाती है।

rDNA तकनीक कई सुनियोजित चरणों का एक जटिल प्रक्रम है:

चरण 1: आनुवंशिक पदार्थ (डीएनए) का विलगन (Isolation of DNA):

कोशिका भित्ति को तोड़ने हेतु विशिष्ट एंजाइम प्रयुक्त होते हैं: जीवाणु हेतु लाइसोजाइम, पादप कोशिका हेतु सेल्युलेज, तथा कवक हेतु काइटिनेज। आरएनए को राइबोन्यूक्लिएज द्वारा तथा प्रोटीन को प्रोटीऐज द्वारा पचाया जाता है। अंत में अत्यधिक शीतित एथेनॉल (Chilled Ethanol) मिलाने पर शुद्ध डीएनए महीन धागों के रूप में अवक्षेपित हो जाता है। इन धागों को चम्मच या छड़ द्वारा बाहर निकालना स्पूलिंग (Spooling) कहलाता है।

चरण 2: एगरोज जेल वैद्युतकणसंचलन (Agarose Gel Electrophoresis):

प्रतिबंधन एंजाइम द्वारा काटे गए डीएनए खंडों को उनके आकार अनुसार पृथक करने की सर्वमान्य विधि:

• डीएनए अणु ऋणावेशित (Negatively charged - फॉस्फेट समूह के कारण) होते हैं, अतः विद्युत क्षेत्र में वे एनोड (धनात्मक इलेक्ट्रोड) की ओर गति करते हैं।
• समुद्री घास (Seaweed) से प्राप्त प्राकृतिक बहुलक एगरोज जेल छन्नी (Sieving effect) का कार्य करता है। डीएनए का खंड जितना छोटा होगा, वह जेल के छिद्रों से उतनी ही अधिक दूर तक गति करेगा।
• डीएनए खंड रंगहीन होते हैं। इन्हें देखने हेतु जेल को एथीडियम ब्रोमाइड (Ethidium Bromide - EtBr) से अभिरंजित किया जाता है तथा पराबैंगनी (UV) प्रकाश के संपर्क में लाया जाता है। इससे डीएनए चमकीले नारंगी रंग की पट्टियों (Bright orange bands) के रूप में दिखाई देते हैं।
• क्षालन (Elution): एगरोज जेल से वांछित डीएनए बैंड को काटकर निकालना तथा जेल के टुकड़े से डीएनए को निष्कर्षित करना क्षालन कहलाता है।

चरण 3: पॉलीमरेज शृंखला अभिक्रिया (Polymerase Chain Reaction - PCR):

1985 में कैरी मुलिस (Kary Mullis) द्वारा विकसित। यह इन विट्रो (In vitro - परखनली में) विधि है जिसके द्वारा डीएनए के किसी विशिष्ट खंड की अरबों प्रतियों का कुछ ही घंटों में प्रवर्धन (Amplification) किया जाता है। इसके तीन मुख्य चरण हैं:

1. विकृतीकरण (Denaturation): उच्च तापमान (लगभग $94^\circ\text{C}$ से $96^\circ\text{C}$) पर डीएनए को गर्म किया जाता है, जिससे दोनों रज्जुकों के बीच के हाइड्रोजन बंध टूट जाते हैं और दोनों रज्जुक अलग-अलग हो जाते हैं।
2. तापानुशीलन (Annealing): तापमान को घटाकर लगभग $50^\circ\text{C}$ से $60^\circ\text{C}$ किया जाता है। दो सेट छोटे रासायनिक संश्लेषित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर्स (Primers) दोनों अलग हुए सांचा रज्जुकों के 3'-सिरों पर जुड़ते हैं।
3. प्रसार / विस्तार (Extension): तापमान $72^\circ\text{C}$ किया जाता है। यहाँ एक विशेष थर्मोस्टेबल (उष्णता-सहनशील) एंजाइम Taq डीएनए पॉलीमरेज (जो गर्म जल के तापीय जीवाणु Thermus aquaticus से निकाला जाता है) माध्यम में उपस्थित डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स (dNTPs) का उपयोग कर प्राइमर को आगे बढ़ाकर नए पूरक रज्जुक का संश्लेषण करता है।

यदि यह चक्र 30 बार दोहराया जाए, तो डीएनए खंड का 1 अरब गुना ($10^9$ गुना) प्रवर्धन हो जाता है!

चरण 4: बायोरिएक्टर एवं अनुप्रवाह संसाधन (Bioreactors & Downstream Processing):

• बायोरिएक्टर (Bioreactors): 100 से 1000 लीटर क्षमता वाले विशाल बर्तन जिनमें सूक्ष्मजीवों, पादप या जंतु कोशिकाओं को वांछित उत्पाद प्राप्त करने हेतु इष्टतम परिस्थितियों (तापमान, pH, क्रियाधार, लवण, विटामिन, ऑक्सीजन) में संवर्धित किया जाता है। प्रायः विलोड़ित हौज बायोरिएक्टर (Stirred-tank bioreactor) प्रयुक्त होता है जिसमें एक विलोड़क (Agitator) लगा होता है जो पूरे बर्तन में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का समान मिश्रण सुनिश्चित करता है।
• अनुप्रवाह संसाधन (Downstream Processing): जैव-संश्लेषण के बाद उत्पाद को बाजार में भेजने से पूर्व किए जाने वाले पृथक्करण (Separation) एवं शोधन (Purification) के प्रक्रमों को सामूहिक रूप से अनुप्रवाह संसाधन कहते हैं। इसमें परिरक्षकों को जोड़ना, गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण (QC) तथा औषधियों के मामले में कड़े नैदानिक परीक्षण (Clinical trials) शामिल होते हैं।