Molecular Basis of Inheritance

डीएनए (Deoxyribonucleic Acid) डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स का एक लंबा बहुलक (Polymer) है। प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड तीन घटकों से मिलकर बना होता है: 1. नाइट्रोजनी क्षारक: प्यूरीन (एडेनिन 'A' तथा ग्वानिन 'G') एवं पिरीमिडीन (साइटोसिन 'C' तथा थायमीन 'T'—आरएनए में थायमीन के स्थान पर यूरेसिल 'U' होता है); 2. पेंटोज शर्करा: 2-डीऑक्सीराइबोज शर्करा; तथा 3. फॉस्फेट समूह: जो फॉस्फोडाइएस्टर बंध द्वारा शर्करा के 5'-कार्बन से जुड़ता है।

वॉटसन एवं क्रिक का द्विकुंडलिनी मॉडल (1953):

रोजालिंड फ्रैंकलिन एवं मौरिस विल्किंस के X-रे विवर्तन (X-ray diffraction) आंकड़ों के आधार पर जेम्स वॉटसन और फ्रांसिस क्रिक ने डीएनए का बी-फॉर्म डबल हेलिक्स मॉडल दिया:

• डीएनए दो पॉलीन्यूक्लियोटाइड शृंखलाओं का बना होता है, जिनका आधार शर्करा-फॉस्फेट का होता है तथा क्षारक अंदर की ओर प्रक्षेपित होते हैं।
• दोनों शृंखलाएं प्रति-समांतर (Anti-parallel) ध्रुवता रखती हैं; यदि एक शृंखला $5' \rightarrow 3'$ दिशा में है, तो दूसरी $3' \rightarrow 5'$ दिशा में होती है।
• दोनों शृंखलाओं के क्षारक आपस में हाइड्रोजन बंधों द्वारा जुड़े होते हैं: एडेनिन, थायमीन से दो हाइड्रोजन बंधों ($A = T$) द्वारा, तथा ग्वानिन, साइटोसिन से तीन हाइड्रोजन बंधों ($G \equiv C$) द्वारा जुड़ता है।
• कुंडल की पिच (Pitch) 3.4 nm (34 Å) होती है तथा प्रत्येक मोड़ में 10 क्षारक युग्म (bp) होते हैं। अतः दो क्रमागत क्षारक युग्मों के बीच की दूरी 0.34 nm ($3.4 \times 10^{-10}\text{ m}$) होती है। डीएनए का व्यास 2 nm (20 Å) होता है।

चारगाफ का समतुल्यता नियम (Erwin Chargaff's Rules):

द्विरज्जुक डीएनए (dsDNA) में प्यूरीन की कुल मात्रा पिरीमिडीन की कुल मात्रा के सदैव बराबर होती है:

किंतु क्षार अनुपात $\frac{A+T}{G+C}$ एक प्रजाति के लिए विशिष्ट व स्थिर होता है, किंतु भिन्न प्रजातियों में भिन्न होता है।

डीएनए कुंडली का संवेष्टन—न्यूक्लियोसोम मॉडल (Nucleosome Model):

मानव की एक द्विगुणित कोशिका में डीएनए की कुल लंबाई लगभग 2.2 मीटर होती है ($6.6 \times 10^9\text{ bp} \times 0.34 \times 10^{-9}\text{ m} \approx 2.24\text{ m}$), जो केवल $10^{-6}\text{ m}$ व्यास वाले केंद्रक में अत्यधिक सघन रूप से पैक होती है:

• हिस्टोन प्रोटीन: धनावेशित एवं क्षारीय प्रोटीन होते हैं, जिनमें क्षारीय अमीनो अम्ल लाइसिन (Lysine) एवं आर्जिनिन (Arginine) प्रचुर मात्रा में पाए जाते हैं।
• हिस्टोन अष्टक (Histone Octamer): हिस्टोन के 4 प्रकारों—$H_2A, H_2B, H_3, H_4$ के दो-दो अणु मिलकर एक 8-प्रोटीन कोर बनाते हैं।
• न्यूक्लियोसोम: ऋणावेशित डीएनए धनावेशित हिस्टोन अष्टक के चारों ओर लगभग $1\frac{3}{4}$ फेरे लपेटता है। एक प्रारूपिक न्यूक्लियोसोम में लगभग 200 क्षारक युग्म (bp) डीएनए होता है।
• लिंकर डीएनए एवं $H_1$ हिस्टोन: दो क्रमागत न्यूक्लियोसोम के बीच के डीएनए को लिंकर डीएनए कहते हैं, जिस पर $H_1$ हिस्टोन प्रोटीन जुड़ती है।
• इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी में क्रोमैटिन 'धागे पर मनके' (Beads-on-a-string) के समान दिखाई देती है।
• यूक्रोमैटिन बनाम हेटरोक्रोमैटिन: यूक्रोमैटिन ढीले बंधे, हल्के रंग के तथा आनुवंशिक रूप से अत्यधिक सक्रिय (Transcriptionally active) होते हैं; जबकि हेटरोक्रोमैटिन घने संवेष्टित, गहरे रंग के तथा अनुलेखन रूप से निष्क्रिय (Inactive) होते हैं।

आनुवंशिक पदार्थ की रासायनिक प्रकृति को सिद्ध करने के लिए तीन ऐतिहासिक मील के पत्थर प्रयोग किए गए:

1. फ्रेडरिक ग्रिफिथ का रूपांतरण प्रयोग (Griffith's Transformation Experiment, 1928):

ग्रिफिथ ने निमोनिया फैलाने वाले जीवाणु Streptococcus pneumoniae के दो प्रभेदों (Strains) का चूहों पर प्रयोग किया:

• S-प्रभेद (Smooth / चिकना): म्यूकोपॉलीसेकेराइड संपुट (Capsule) युक्त, उग्र / रोगजनक (Virulent)। चूहों में निमोनिया से मृत्यु हो जाती है।
• R-प्रभेद (Rough / खुरदरा): संपुट-विहीन, अनुग्र / अहानिकर (Non-virulent)। चूहे जीवित रहते हैं।

प्रायोगिक चरण:

1. जीवित S-प्रभेद $\rightarrow$ चूहे में अंतःक्षेपित $\rightarrow$ चूहा मर गया।
2. जीवित R-प्रभेद $\rightarrow$ चूहे में अंतःक्षेपित $\rightarrow$ चूहा जीवित रहा।
3. ताप-मृत S-प्रभेद (Heat-killed S) $\rightarrow$ चूहे में अंतःक्षेपित $\rightarrow$ चूहा जीवित रहा।
4. ताप-मृत S-प्रभेद + जीवित R-प्रभेद का मिश्रण $\rightarrow$ चूहे में अंतःक्षेपित $\rightarrow$ चूहा मर गया! तथा मृत चूहे के रक्त से जीवित S-प्रभेद जीवाणु प्राप्त हुए!

निष्कर्ष: ताप-मृत S जीवाणुओं से कोई पदार्थ जीवित R जीवाणुओं में स्थानांतरित हुआ जिसने R जीवाणुओं को संपुटयुक्त उग्र S जीवाणुओं में 'रूपांतरित' (Transform) कर दिया। इसे ग्रिफिथ ने 'रूपांतरणकारी सिद्धांत' (Transforming Principle) कहा।

2. एवरी, मैकलियोड तथा मैकार्थी का जैव-रासायनिक प्रमाण (1944):

ओसवाल्ड एवरी, कॉलिन मैकलियोड तथा मैकलिन मैकार्थी ने ताप-मृत S कोशिकाओं से शुद्ध किए गए प्रोटीनों, आरएनए तथा डीएनए का अलग-अलग एंजाइमों द्वारा पाचन किया:

• प्रोटीऐज (Protease) मिलाने पर भी रूपांतरण नहीं रुका।
• आरएनएऐज (RNase) मिलाने पर भी रूपांतरण नहीं रुका।
• किंतु जब डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिएज (DNase) मिलाया गया, तो रूपांतरण पूर्णतः रुक गया!

इससे निर्विवाद सिद्ध हुआ कि रूपांतरणकारी सिद्धांत डीएनए ही है, प्रोटीन या आरएनए नहीं।

3. अल्फ्रेड हर्षे एवं मार्था चेस का प्रयोग (Hershey-Chase Experiment, 1952):

यह डीएनए के आनुवंशिक पदार्थ होने का 'अंतिम सर्वमान्य प्रमाण' (Unequivocal Proof) माना जाता है। उन्होंने जीवाणुभोजी टी-2 (Bacteriophage $T_2$) तथा E. coli जीवाणु का उपयोग किया:

• रेडियोधर्मी सल्फर ($^{35}S$): सल्फर प्रोटीन (मेथियोनीन व सिस्टीन) में पाया जाता है, डीएनए में नहीं। इससे विषाणु का प्रोटीन आवरण (Capsid) रेडियोधर्मी हो गया।
• रेडियोधर्मी फॉस्फोरस ($^{32}P$): फॉस्फोरस डीएनए में पाया जाता है, प्रोटीन में नहीं। इससे विषाणु का डीएनए रेडियोधर्मी हो गया।

प्रयोग के तीन चरण:

1. संक्रमण (Infection): रेडियोधर्मी फेजों को E. coli जीवाणुओं को संक्रमित करने दिया गया।
2. मंथन / विलोडन (Blending): ब्लेंडर में हिलाकर विषाणु आवरणों को जीवाणु कोशिका की सतह से अलग किया गया।
3. अपकेंद्रण (Centrifugation): अपकेंद्रित्र में घुमाकर भारी जीवाणु कोशिकाओं को तलछट (Pellet) में तथा हल्के विषाणु आवरणों को अधिपलावी (Supernatant) में पृथक किया गया।

परिणाम: $^{32}P$ युक्त समूह में रेडियोधर्मिता तलछट (जीवाणु कोशिकाओं के भीतर) पाई गई, जबकि $^{35}S$ युक्त समूह में रेडियोधर्मिता अधिपलावी (विषाणु खोल) में रही। अंतिम निष्कर्ष: जीवाणु में प्रवेश करने वाला तथा संतानों में जाने वाला पदार्थ डीएनए ही है, अतः डीएनए ही आनुवंशिक पदार्थ है।

वॉटसन तथा क्रिक ने डीएनए मॉडल प्रस्तुत करते ही कहा था: 'हमारे द्वारा कल्पित विशिष्ट युग्मन के आधार पर आनुवंशिक पदार्थ के प्रतिलिपिकरण (Replication) की क्रियाविधि का स्वतः सुझाव मिलता है।' इसे अर्ध-संरक्षी प्रतिकृतियन (Semi-conservative Replication) कहते हैं, जिसमें मातृ डीएनए के दोनों रज्जुक अलग होकर नए पूरक रज्जुकों के निर्माण हेतु सांचे (Template) का कार्य करते हैं। प्रत्येक नई संतति डीएनए में एक पुराना रज्जुक और एक नवनिर्मित रज्जुक होता है।

मेसल्सन एवं स्टाल का प्रायोगिक प्रमाण (Meselson & Stahl Experiment, 1958):

1. उन्होंने E. coli जीवाणु को कई पीढ़ियों तक भारी नाइट्रोजन युक्त माध्यम ($^{15}NH_4Cl$) में उगाया, जिससे संपूर्ण डीएनए भारी ($^{15}N-^{15}N$) हो गया। भारी डीएनए को सीजियम क्लोराइड (CsCl) के घनत्व प्रवणता अपकेंद्रण (Density Gradient Centrifugation) द्वारा पृथक किया गया।
2. फिर इन जीवाणुओं को सामान्य हल्के नाइट्रोजन माध्यम ($^{14}NH_4Cl$) में स्थानांतरित किया गया।
3. 20 मिनट बाद (प्रथम पीढ़ी): निकाले गए डीएनए का घनत्व भारी और हल्के के ठीक बीच का संकर (Hybrid: $^{15}N-^{14}N$) प्राप्त हुआ।
4. 40 मिनट बाद (द्वितीय पीढ़ी): डीएनए में 50% संकर ($^{15}N-^{14}N$) तथा 50% हल्का ($^{14}N-^{14}N$) डीएनए प्राप्त हुआ।

इस प्रयोग ने अकाट्य रूप से सिद्ध कर दिया कि डीएनए का प्रतिकृतियन अर्ध-संरक्षी होता है। (टेलर एवं सहयोगियों ने 1958 में Vicia faba की मूल कोशिकाओं में ट्राइटिएटेड थाइमिडीन का उपयोग कर गुणसूत्रों में अर्ध-संरक्षी द्विगुणन सिद्ध किया)।

डीएनए प्रतिकृतियन की आणविक मशीनरी (Replication Fork Machinery):

• प्रतिकृतियन की उत्पत्ति (Origin of Replication - Ori): डीएनए में वह विशिष्ट बिंदु जहाँ से द्विगुणन प्रारंभ होता है।
• हेलिकेस (Helicase): दोनों रज्जुकों के बीच के हाइड्रोजन बंधों को तोड़कर डीएनए द्विकुंडलिनी को खोलता है, जिससे Y-आकार का प्रतिकृतियन द्विशाख (Replication Fork) बनता है।
• टोपोआइसोमरेज / डीएनए गाइरेस: डीएनए के खुलने से उत्पन्न अतिरिक्त तनाव (Supercoiling tension) को दूर करता है।
• आरएनए प्राइमेज: डीएनए पॉलीमरेज स्वयं नया रज्जुक प्रारंभ नहीं कर सकता, अतः प्राइमेज 5-10 न्यूक्लियोटाइड लंबा छोटा आरएनए प्राइमर बनाता है।
• डीएनए-निर्भर डीएनए पॉलीमरेज III: यह मुख्य एंजाइम है जो $5' \rightarrow 3'$ दिशा में अत्यधिक उच्च गति (लगभग 2000 bp प्रति सेकंड) एवं अत्यधिक उच्च परिशुद्धता के साथ नए रज्जुक का बहुलकीकरण करता है।
• अग्रणी रज्जुक (Leading Strand): $3' \rightarrow 5'$ सांचे पर बनने वाला रज्जुक सतत (Continuous) रूप से $5' \rightarrow 3'$ दिशा में बनता है।
• पश्चगामी रज्जुक (Lagging Strand): $5' \rightarrow 3'$ सांचे पर नया रज्जुक छोटे-छोटे टुकड़ों में असतत (Discontinuous) रूप से बनता है। इन छोटे टुकड़ों को ओकाजाकी खंड (Okazaki Fragments) कहते हैं।
• डीएनए लाइगेज (DNA Ligase): यह आणविक गोंद (Molecular Glue) की तरह ओकाजाकी खंडों को फॉस्फोडाइएस्टर बंध द्वारा आपस में जोड़ देता है।

केंद्रीय सिद्धांत (Central Dogma of Molecular Biology): 1958 में फ्रांसिस क्रिक ने प्रतिपादित किया कि आनुवंशिक सूचनाओं का प्रवाह एकदिशीय होता है:

(रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन / टेमिनिज्म: रेट्रोवायरस जैसे HIV में आरएनए से डीएनए बनता है: $\text{RNA} \xrightarrow{\text{Reverse Transcriptase}} \text{cDNA}$)।

अनुलेखन इकाई (Transcription Unit):

डीएनए के रज्जुक से आनुवंशिक सूचनाओं का आरएनए में प्रतिलिपिकरण अनुलेखन कहलाता है। इसके तीन मुख्य भाग होते हैं:

1. उन्नायक (Promoter): संरचनात्मक जीन के 5'-सिरे (अपस्ट्रीम) पर स्थित डीएनए अनुक्रम, जहाँ आरएनए पॉलीमरेज एंजाइम जुड़ता है।
2. संरचनात्मक जीन (Structural Gene): दो रज्जुकों में से $3' \rightarrow 5'$ ध्रुवता वाला रज्जुक सांचा रज्जुक (Template strand) कहलाता है, जिसका अनुलेखन होता है। दूसरा रज्जुक ($5' \rightarrow 3'$) कूटलेखन रज्जुक (Coding strand) कहलाता है (जिसका क्रम आरएनए के समान होता है, बस T के स्थान पर U होता है)।
3. समापक (Terminator): 3'-सिरे (डाउनस्ट्रीम) पर स्थित अनुक्रम जहाँ अनुलेखन प्रक्रिया समाप्त होती है।

यूकेरियोट्स में पश्च-अनुलेखन संपादन (Post-Transcriptional Processing):

यूकेरियोट्स में प्राथमिक अनुलेख (hnRNA - Heterogeneous nuclear RNA) में कार्यात्मक और अकार्यात्मक दोनों भाग होते हैं। इसके परिपक्वन हेतु तीन प्रक्रियाएं होती हैं:

• स्प्लिसिंग (Splicing - समबंधन): अकार्यात्मक अनुक्रमों यानी इंट्रॉन्स (Introns) को काटकर अलग किया जाता है तथा कार्यात्मक अनुक्रमों यानी एक्सॉन्स (Exons) को एक निश्चित क्रम में लाइगेज द्वारा जोड़ा जाता है।
• कैपिंग (Capping - आच्छादन): hnRNA के 5'-सिरे पर एक असामान्य न्यूक्लियोटाइड—मिथाइल ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट ($m^7G_{ppp}$) जोड़ा जाता है।
• पॉलीएडिनाइलेशन टेलिंग (Tailing - पुच्छन): 3'-सिरे पर लगभग 200–300 एडेनाइलेट अवशेष (Poly-A tail) जोड़े जाते हैं। अब यह पूर्ण परिपक्व mRNA कहलाता है जो केंद्रक से कोशिकाद्रव्य में आता है।

आनुवंशिक कूट की प्रमुख विशेषताएं (Salient Features of Genetic Code):

• त्रिक कूट (Triplet Code): कुल $4^3 = 64$ कोडॉन होते हैं। इनमें से 61 कोडॉन 20 अमीनो अम्लों को कोड करते हैं, जबकि 3 कोडॉन समापक कोडॉन हैं।
• प्रारंभक कोडॉन (Initiator Codon): AUG दोहरा कार्य करता है—यह प्रोटीन निर्माण प्रारंभ करता है तथा मेथियोनीन (Methionine) अमीनो अम्ल को कोड करता है।
• समापक कोडॉन (Stop / Nonsense Codons): UAA (ओकर), UAG (अम्बर), UGA (ओपल) किसी भी अमीनो अम्ल को कोड नहीं करते और अनुवाद को समाप्त करते हैं।
• असंदिग्ध एवं विशिष्ट (Unambiguous & Specific): एक विशेष कोडॉन सदैव केवल एक ही विशिष्ट अमीनो अम्ल को कोड करता है।
• अपभ्रष्ट (Degenerate): कुछ अमीनो अम्ल एक से अधिक कोडॉनों द्वारा कोड किए जाते हैं (जैसे ल्यूसीन, सिरीन, आर्जीनिन को 6-6 कोडॉन कोड करते हैं)।
• विरामहीन (Comma-less): mRNA पर कोडॉन बिना किसी विराम (Punctuation) के निरंतर पढ़े जाते हैं।
• सार्वभौमिक (Universal): जीवाणु से लेकर मानव तक UUU सदैव फेनिलएलनिन को ही कोड करता है (कुछ माइटोकॉन्ड्रियल कोडॉनों को छोड़कर)।

लैक ओपेरॉन (Lac Operon Model): 1961 में फ्रांकोइस जैकब (आनुवंशिकीविद्) तथा जैक्स मोनोड (जैव-रसायनज्ञ) ने E. coli में लैक्टोज के उपापचय के नियमन हेतु ओपेरॉन मॉडल प्रस्तुत किया। यह जीन अभिव्यक्ति के ऋणात्मक एवं प्रेरणीय नियमन (Negative & Inducible Regulation) का आदर्श उदाहरण है।

लैक ओपेरॉन के घटक:

• नियामक जीन ($i$ जीन - Inhibitor): यह निरंतर (Constitutive) रूप से लैक दमनकारी (Repressor) प्रोटीन का निर्माण करता है।
• प्रमोटर जीन ($p$): जहाँ आरएनए पॉलीमरेज जुड़ता है।
• ऑपरेटर जीन ($o$ - प्रचालक): जिस पर दमनकारी प्रोटीन जुड़कर आरएनए पॉलीमरेज के मार्ग को अवरुद्ध कर देती है।
• संरचनात्मक जीन (Structural Genes): पॉलीसिस्ट्रोनिक क्रम में तीन जीन होते हैं:
  1. $z$ जीन: $\\beta$-गैलेक्टोसिडेस ($\\beta$-galactosidase) बनाता है, जो लैक्टोज को ग्लूकोज एवं गैलेक्टोज में तोड़ता है।
  2. $y$ जीन: पर्मिएज (Permease) बनाता है, जो जीवाणु कोशिका में लैक्टोज की पारगम्यता बढ़ाता है।
  3. $a$ जीन: ट्रांसएसिटाइलेज (Transacetylase) बनाता है, जो एसिटाइल समूह का स्थानांतरण करता है।

कार्यप्रणाली:
• प्रेरक (Lactose) की अनुपस्थिति में (Switch OFF): दमनकारी प्रोटीन ऑपरेटर ($o$) से जुड़ जाती है, जिससे आरएनए पॉलीमरेज संरचनात्मक जीनों का अनुलेखन नहीं कर पाता।
• प्रेरक (Lactose / Allolactose) की उपस्थिति में (Switch ON): लैक्टोज दमनकारी प्रोटीन से जुड़कर उसे निष्क्रिय कर देता है। अब दमनकारी ऑपरेटर से नहीं जुड़ पाती, आरएनए पॉलीमरेज ऑपरेटर से होकर आगे बढ़ जाता है और $z, y, a$ जीनों का अनुलेखन करके तीनों एंजाइम बना देता है।

मानव जीनोम परियोजना (Human Genome Project - HGP):

1990 से 2003 तक चला 13-वर्षीय 'मेगा प्रोजेक्ट' जिसमें मानव जीनोम के संपूर्ण $3.1647 \times 10^9$ bp का अनुक्रमण किया गया।

• मानव जीनोम में लगभग 30,000 जीन उपस्थित हैं (पहले अनुमानित 80,000–1,00,000 से बहुत कम)।
• औसत जीन में 3000 क्षारक होते हैं; सबसे बड़ा ज्ञात मानव जीन डिस्ट्रॉफिन (Dystrophin - 2.4 मिलियन क्षारक) है।
• जीनोम का 2% से भी कम भाग प्रोटीनों का कूटलेखन करता है; अधिकांश भाग पुनरावृत्त अनुक्रमों (Repetitive sequences) से बना है।
• गुणसूत्र 1 पर सर्वाधिक जीन (2968) तथा Y गुणसूत्र पर सबसे कम जीन (231) हैं।
• लगभग 1.4 मिलियन स्थानों पर एकल क्षारक बहुरूपता (SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms) पाई जाती है।

डीएनए फिंगरप्रिंटिंग (DNA Fingerprinting):

1985 में सर एलेक जेफ्रीज (Alec Jeffreys) द्वारा विकसित तकनीक (भारत में डॉ. लालजी सिंह को इसका जनक माना जाता है)। यह तकनीक जीनोम के उस हिस्से पर आधारित है जिसे सेटेलाइट डीएनए (अनुषंगी डीएनए) कहते हैं, जिसमें उच्च स्तर की बहुरूपता (DNA Polymorphism) तथा VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - अनुषंगी लघु पुनरावृत्तियां) पाई जाती हैं।

डीएनए फिंगरप्रिंटिंग के मुख्य चरण:

1. कोशिका से डीएनए का निष्कर्षण एवं विलगन।
2. प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज (Restriction Endonuclease) एंजाइम द्वारा डीएनए का पाचन (विशिष्ट खंडों में काटना)।
3. एगरोज जेल वैद्युतकणसंचलन (Agarose Gel Electrophoresis) द्वारा डीएनए खंडों का आकार अनुसार पृथक्करण।
4. सदर्न ब्लॉटिंग (Southern Blotting): जेल से डीएनए खंडों को संश्लेषित झिल्ली (नायलॉन अथवा नाइट्रोसेल्युलोज) पर स्थानांतरित करना।
5. रेडियोधर्मी चिह्नित VNTR प्रोब (Probe) द्वारा संकरण (Hybridization)।
6. ऑटोरेलोग्राफी (Autoradiography) द्वारा एक्स-रे फिल्म पर संकरित डीएनए पट्टियों (Bands) का प्रलेखीकरण। यह बैंडिंग पैटर्न प्रत्येक व्यक्ति के लिए विशिष्ट होता है।