Molecular Basis of Inheritance

डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक अम्ल (DNA) तथा राइबोन्यूक्लिक अम्ल (RNA) न्यूक्लियोटाइड नामक एकलक इकाइयों के रैखिक बहुलक हैं। प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड तीन रासायनिक घटकों से मिलकर बना होता है:

• पेंटोज शर्करा (5-कार्बन शर्करा): डीएनए में $\beta$-D-2-डीऑक्सीराइबोज शर्करा होती है जिसके $C2'$ कार्बन पर ऑक्सीजन अनुपस्थित होता है, जिससे डीएनए रासायनिक रूप से अत्यधिक स्थिर होता है। आरएनए में $\beta$-D-राइबोज शर्करा पाई जाती है जिसके $C2'$ स्थिति पर एक मुक्त व अत्यधिक सक्रिय $-OH$ समूह होता है, जो आरएनए को उत्प्रेरकीय एवं क्रियाशील बनाता है।
• नाइट्रोजनी क्षारक (Heterocyclic Bases):
  • प्यूरीन (Purines - द्विवलयी): एडेनिन ($A$) एवं ग्वानिन ($G$)। ये शर्करा के $C1'$ कार्बन से $N9-C1'$ $\beta$-N-ग्लाइकोसिडिक बंध द्वारा जुड़े होते हैं।
  • पिरिमिडीन (Pyrimidines - एकवलयी): साइटोसिन ($C$), थायमीन ($T$ - केवल डीएनए में), तथा यूरेसिल ($U$ - केवल आरएनए में)। ये शर्करा के $C1'$ कार्बन से $N1-C1'$ $\beta$-N-ग्लाइकोसिडिक बंध द्वारा जुड़े होते हैं। थायमीन का रासायनिक नाम 5-मेथिल यूरेसिल है, जिसका मेथिल समूह डीएनए को प्रकाश-अपघटन से सुरक्षा प्रदान करता है।
• फॉस्फेट समूह: फॉस्फोरिक अम्ल ($H_3PO_4$) न्यूक्लियोसाइड के $5'-OH$ सिरे से फॉस्फोएस्टर बंध द्वारा जुड़ता है। दो न्यूक्लियोटाइड आपस में $3' \to 5'$ फॉस्फोडाइएस्टर बंध द्वारा जुड़कर शर्करा-फॉस्फेट की आधारभूत रीढ़ बनाते हैं।

इरविन चारगाफ ने विभिन्न जीवों के द्विरज्जुक डीएनए (dsDNA) का क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण करके चार सार्वभौमिक नियम प्रतिपादित किए (यह नियम एकल-रज्जुक डीएनए या आरएनए पर लागू नहीं होते):

• क्षार समतुल्यता: एडेनिन की मोलर मात्रा थायमीन के बराबर ($[A] = [T]$) तथा ग्वानिन की मात्रा साइटोसिन के बराबर ($[G] = [C]$) होती है।
• प्यूरीन = पिरिमिडीन: कुल प्यूरीन की मात्रा कुल पिरिमिडीन के बराबर होती है: $[A] + [G] = [T] + [C]$, अर्थात् $\frac{[A] + [G]}{[T] + [C]} = 1.0$।
• विशिष्ट क्षार अनुपात (Base Ratio): $\frac{[A] + [T]}{[G] + [C]}$ का मान किसी एक जाति के लिए नियत होता है, किंतु विभिन्न जातियों में भिन्न होता है। यूकेरियोट्स में यह अनुपात सामान्यतः $> 1$ ($AT$-प्रकार) तथा प्रोकैरियोट्स में $< 1$ ($GC$-प्रकार) होता है।

रोज़ालिंड फ्रैंकलिन और मौरिस विल्किंस के एक्स-रे विवर्तन (X-ray diffraction) डेटा के आधार पर जेम्स वाटसन और फ्रांसिस क्रिक ने B-DNA का द्विकुंडलिनी मॉडल प्रस्तुत किया, जिसके मुख्य ज्यामितीय लक्षण निम्नलिखित हैं:

• प्रतिसमांतर रज्जुक (Antiparallel Strands): डीएनए दो पॉलीन्यूक्लियोटाइड श्रृंखलाओं से बना होता है जो विपरीत ध्रुवीयता ($5' \to 3'$ एवं $3' \to 5'$) में स्थित होती हैं।
• पूरक क्षार युग्मन (Complementary Base Pairing): एडेनिन थायमीन के साथ दो हाइड्रोजन बंधों द्वारा ($A = T$) तथा ग्वानिन साइटोसिन के साथ तीन हाइड्रोजन बंधों द्वारा ($G \equiv C$) जुड़ता है।
• कुंडलिनी के आयाम: द्विकुंडलिनी का व्यास $2.0\text{ nm}$ ($20\text{ \AA}$) होता है। यह एक दक्षिणावर्ती (right-handed) कुंडल है जिसकी पिच (एक पूर्ण घुमाव) की लंबाई $3.4\text{ nm}$ ($34\text{ \AA}$) होती है। प्रत्येक घुमाव में 10 क्षार युग्म (base pairs) होते हैं, अतः दो क्रमिक क्षार युग्मों के बीच की दूरी $0.34\text{ nm}$ ($3.4\text{ \AA}$) होती है।

ब्रिटिश चिकित्सा विज्ञानी फ्रेडरिक ग्रिफिथ ने Streptococcus pneumoniae (न्यूमोकोकस) के दो प्रभेदों (strains) का उपयोग करके चूहों पर ऐतिहासिक प्रयोग किए:

• S-III प्रभेद (Smooth / उग्र): पॉलीसेकेराइड का चिकना सुरक्षात्मक कैप्सूल उपस्थित; रोगजनक (virulent) होता है और चूहों में निमोनिया उत्पन्न कर उनकी मृत्यु का कारण बनता है।
• R-II प्रभेद (Rough / अनुग्र): कैप्सूल अनुपस्थित, खुरदरी सतह; गैर-रोगजनक (avirulent/non-pathogenic) होता है, चूहे जीवित रहते हैं।

ओसवाल्ड एवेरी, कोलिन मैकलॉयड और मैकलीन मैक्कार्थी ने ताप-मृत S कोशिकाओं से कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, आरएनए और डीएनए को शुद्ध करके पाचक एंजाइमों से उपचारित किया:

• प्रोटिएज (Protease) एवं आरनेज (RNase) से उपचार: प्रोटीन और आरएनए के पाचन के उपरांत भी रूपांतरण सामान्य रूप से संपन्न हुआ। इससे सिद्ध हुआ कि प्रोटीन और आरएनए आनुवंशिक पदार्थ नहीं हैं।
• डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिएज (DNase) से उपचार: जब डीएनए को DNase एंजाइम द्वारा विखंडित कर दिया गया, तब रूपांतरण पूर्णतः अवरुद्ध हो गया। इससे निर्विवाद रूप से सिद्ध हुआ कि रूपांतरणकारी सिद्धांत केवल डीएनए ही है।

हर्षे एवं चेस ने बैक्टीरियोफेज $T_2$ और Escherichia coli जीवाणु का उपयोग करके रेडियोधर्मी समस्थानिकों द्वारा अंतिम प्रमाण प्रस्तुत किया:

• रेडियोधर्मी लेबलिंग: एक संवर्धन माध्यम में फॉस्फोरस का रेडियोधर्मी समस्थानिक $^{32}P$ मिलाया गया जो केवल फेज के डीएनए में समाविष्ट हुआ (प्रोटीन में फॉस्फोरस अनुपस्थित होता है)। दूसरे माध्यम में सल्फर का समस्थानिक $^{35}S$ मिलाया गया जो फेज के प्रोटीन आवरण (कैप्सिड) के सिस्टीन व मेथियोनीन अमीनो अम्लों में समाविष्ट हुआ (डीएनए में सल्फर नहीं होता)।
• संक्रमण (Infection): रेडियोधर्मी जीवाणुभोजी विषाणुओं को सामान्य E. coli जीवाणुओं को संक्रमित करने दिया गया।
• सम्मिश्रण (Blending): किचन ब्लेंडर में हिलाकर जीवाणु कोशिका की सतह से विषाणु आवरण को अलग किया गया।
• अपकेंद्रण (Centrifugation): उच्च गति अपकेंद्रण करने पर भारी जीवाणु कोशिकाएं परखनली के तल में अवसाद (Pellet) के रूप में बैठ गईं, जबकि हल्के खाली विषाणु खोल (Ghosts) ऊपर तैरते तरल (Supernatant) में रह गए।
• परिणाम: $^{32}P$-लेबल वाले प्रयोग में रेडियोधर्मिता अवसाद (जीवाणु कोशिकाओं) में पाई गई, जबकि $^{35}S$-लेबल वाले प्रयोग में रेडियोधर्मिता प्लावन (तरल) में पाई गई। इससे अंतिम रूप से सिद्ध हो गया कि जीवाणु में प्रवेश करने वाला आनुवंशिक पदार्थ डीएनए ही है, प्रोटीन नहीं।

एक मानव द्विगुणित कायिक कोशिका में लगभग $6.6 \times 10^9$ क्षार युग्म होते हैं। प्रत्येक युग्म के बीच की दूरी $0.34\text{ nm}$ ($0.34 \times 10^{-9}\text{ m}$) होने के कारण डीएनए की कुल लंबाई:

कुल लंबाई = $6.6 \times 10^9 \times 0.34 \times 10^{-9}\text{ m} \approx 2.24\text{ मीटर}$

इस $2.24\text{ m}$ लंबे अत्यधिक ऋणावेशित डीएनए को मात्र $10^{-6}\text{ m}$ ($6-10\text{ \mu m}$) व्यास वाले सूक्ष्म केंद्रक में समाहित करने के लिए उच्च स्तरीय संवेष्टन (पैकेजिंग) अनिवार्य है।

यूकेरियोट्स में डीएनए की पैकेजिंग धनावेशित क्षारीय प्रोटीनों द्वारा होती है जिन्हें हिस्टोन (Histones) कहते हैं। हिस्टोन प्रोटीन धनावेशित अमीनो अम्लों लाइसिन (Lysine) एवं आर्जिनिन (Arginine) से भरपूर होते हैं:

• हिस्टोन ऑक्टामर (Core Octamer): चार प्रकार के कोर हिस्टोन ($H2A, H2B, H3, H4$) के दो-दो अणु मिलकर एक अष्टक (octamer) बनाते हैं।
• कोर डीएनए (Core DNA): लगभग 146 क्षार युग्म (bp) लंबा डीएनए इस ऑक्टामर के चारों ओर $1.65$ से $1.75$ दक्षिणावर्ती घुमावों में लिपटा रहता है।
• लिंकर डीएनए एवं $H1$ हिस्टोन: दो क्रमिक न्यूक्लियोसोम को जोड़ने वाले लगभग $54\text{ bp}$ लंबे डीएनए को लिंकर डीएनए कहते हैं, जिसके साथ $H1$ हिस्टोन (प्लग प्रोटीन) जुड़ा होता है। इस प्रकार एक पूर्ण न्यूक्लियोसोम इकाई में लगभग $200\text{ bp}$ डीएनए समाहित होता है।
• डोरी पर मनके (Beads-on-a-string): इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी में यह $10\text{ nm}$ चौड़ी तंतुमय संरचना डोरी पर पिरोए गए मोतियों के समान दिखाई देती है।

• $2\text{ nm}$ डीएनए द्विकुंडलिनी $\to$ $10\text{ nm}$ न्यूक्लियोसोम माला $\to$ $30\text{ nm}$ सोलेनोइड तंतु (प्रति घुमाव 6 न्यूक्लियोसोम) $\to$ $300\text{ nm}$ लूपयुक्त क्रोमेटिन डोमेन $\to$ $700\text{ nm}$ क्रोमैटिड $\to$ $1400\text{ nm}$ मध्यावस्था गुणसूत्र (Metaphase Chromosome)।
• उच्च स्तरीय पैकेजिंग के लिए अतिरिक्त प्रोटीनों के समूह की आवश्यकता होती है जिन्हें गैर-हिस्टोन गुणसूत्रीय प्रोटीन (NHC - Non-histone Chromosomal Proteins) कहा जाता है।

वाटसन एवं क्रिक द्वारा परिकल्पित अर्ध-संरक्षी प्रतिकृतियन (Semiconservative Replication) का प्रायोगिक प्रमाण मेसल्सन एवं स्टाल ने E. coli पर भारी समस्थानिक $^{15}N$ और सीजियम क्लोराइड ($CsCl$) घनत्व प्रवणता अपकेंद्रण द्वारा दिया:

• पीढ़ी 0: जीवाणुओं को कई पीढ़ियों तक $^{15}NH_4Cl$ युक्त माध्यम में संवर्धित किया गया। उनका संपूर्ण डीएनए भारी ($^{15}N-^{15}N$) हो गया, जो $CsCl$ में तल के निकट एक भारी बैंड बनाता है।
• पीढ़ी 1 (20 मिनट पश्चात - 1 कोशिका विभाजन): जीवाणुओं को सामान्य $^{14}NH_4Cl$ माध्यम में स्थानांतरित किया गया। निष्कर्षित डीएनए ने केवल एक मध्यवर्ती संकर घनत्व वाला बैंड ($^{15}N-^{14}N$) प्रदर्शित किया। इसने पूर्ण संरक्षी मॉडल को खारिज कर दिया।
• पीढ़ी 2 (40 मिनट पश्चात - 2 कोशिका विभाजन): डीएनए में दो समान अनुपात वाले बैंड प्राप्त हुए: 50% संकर ($^{15}N-^{14}N$) तथा 50% हल्का ($^{14}N-^{14}N$)। इसने अर्ध-संरक्षी प्रतिकृतियन की अचूक पुष्टि की।
• (नोट: टेलर एवं उनके सहयोगियों ने 1958 में Vicia faba की मूल कोशिकाओं में $^{3}H$-थायमिडीन का प्रयोग करके गुणसूत्रों में अर्ध-संरक्षी प्रतिकृतियन सिद्ध किया)।

डीएनए प्रतिकृतियन एक विशिष्ट स्थल से प्रारंभ होता है जिसे प्रतिकृतियन मूल (oriC) कहते हैं। प्रतिकृतियन द्विशाख पर कार्यरत प्रमुख एंजाइम निम्नलिखित हैं:

• डीएनए हेलिकेज (DNA Helicase): एटीपी ऊर्जा का उपयोग करके द्विकुंडलिनी के हाइड्रोजन बंधों को तोड़कर दोनों रज्जुक को खोलता है।
• एकल रज्जुक बंधन प्रोटीन (SSBP): पृथक हुए एकल रज्जुकों को पुनः आपस में जुड़ने से रोकता है और उन्हें स्थायित्व प्रदान करता है।
• टोपोआइसोमरेज / डीएनए गाइरेज: हेलिकेज द्वारा रज्जुकों के खुलने से उत्पन्न घूर्णन तनाव (supercoiling strain) को फॉस्फोडाइएस्टर बंध को अस्थायी रूप से काटकर व पुनः जोड़कर मुक्त करता है।
• आरएनए प्राइमेज (RNA Primase): डीएनए सांचे पर एक छोटा (10-12 न्यूक्लियोटाइड लंबा) आरएनए प्राइमर संश्लेषित करता है, जो मुक्त $3'-OH$ सिरा उपलब्ध कराता है।
• डीएनए पॉलीमरेज III (DNA Pol III): मुख्य प्रतिकृतियन एंजाइम जो $5' \to 3'$ दिशा में तीव्र गति (~2000 bp प्रति सेकंड) और उच्च सटीकता के साथ बहुलकीकरण करता है। इसमें $3' \to 5'$ प्रूफरीडिंग एक्सोन्यूक्लिएज सक्रियता होती है।
• डीएनए पॉलीमरेज I (Kornberg Enzyme): अपनी $5' \to 3'$ एक्सोन्यूक्लिएज सक्रियता द्वारा आरएनए प्राइमर को हटाता है और रिक्त स्थान को डीएनए न्यूक्लियोटाइड्स से भरता है।
• डीएनए लाइगेज (DNA Ligase): नवसंश्लेषित ओकाजाकी खंडों के मध्य $3'-OH$ और $5'-P$ के बीच फॉस्फोडाइएस्टर बंध बनाकर सील करता है।

फ्रांसिस क्रिक (1958) द्वारा प्रतिपादित सेंट्रल डोग्मा आनुवंशिक सूचना के एकदिशीय प्रवाह को दर्शाता है: $\text{DNA} \xrightarrow{\text{अनुलेखन}} \text{mRNA} \xrightarrow{\text{रूपांतरण}} \text{प्रोटीन}$। (रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम द्वारा आरएनए से डीएनए का निर्माण रिवर्स सेंट्रल डोग्मा कहलाता है)।

डीएनए की अनुलेखन इकाई में तीन संरचनात्मक घटक होते हैं:

• उन्नायक (Promoter): संरचनात्मक जीन के $5'$ सिरे (अपस्ट्रीम) पर स्थित डीएनए अनुक्रम जहां आरएनए पॉलीमरेज एंजाइम बंधता है (जैसे TATA बॉक्स या प्रिबनो बॉक्स)।
• संरचनात्मक जीन (Structural Gene): सांचा रज्जुक ($3' \to 5'$ ध्रुवीयता, जिसका अनुलेखन होता है) तथा कूटलेखन रज्जुक ($5' \to 3'$ ध्रुवीयता, जिसका क्रम नवनिर्मित आरएनए के समान होता है केवल $T$ के स्थान पर $U$ होता है)।
• समापक (Terminator): संरचनात्मक जीन के $3'$ सिरे (डाउनस्ट्रीम) पर स्थित अनुक्रम जो अनुलेखन प्रक्रिया को समाप्त करता है।

यूकेरियोट्स में अनुलेखन के पश्चात प्राथमिक अनुलेख ($hnRNA$) को परिपक्व $mRNA$ में बदलने के लिए तीन जटिल प्रक्रियाएं होती हैं:

• कैपिंग (Capping): $hnRNA$ के $5'$ सिरे पर एक असामान्य न्यूक्लियोटाइड मिथाइल ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट ($m^7Gppp$) जोड़ा जाता है जो राइबोसोम पहचान एवं सुरक्षा प्रदान करता है।
• पुच्छन (Tailing / Polyadenylation): $3'$ सिरे पर लगभग 200-300 एडेनिलिक अम्ल अवशेष (Poly-A Tail) जोड़े जाते हैं।
• समबंधन / स्प्लिसिंग (Splicing): स्प्लिसियोसोम कॉम्प्लेक्स द्वारा गैर-कूटलेखन अंतरालों (इंट्रॉन - Introns) को काटकर अलग किया जाता है और कूटलेखन खंडों (एक्सॉन - Exons) को एक निश्चित क्रम में लाइगेज द्वारा जोड़ दिया जाता है।

tRNA (एडेप्टर अणु) की क्लोवर-लीफ द्वितीयक संरचना में एक एंटीकोडॉन लूप तथा $3'$ सिरे पर अमीनो अम्ल ग्राही स्थल ($CCA-3'$) होता है। रूपांतरण प्रक्रिया चार मुख्य चरणों में संपन्न होती है:

• tRNA का अमीनोएसिलेशन (आवेशन): अमीनो अम्ल एटीपी की उपस्थिति में अमीनोएसिल-tRNA सिंथेटेज एंजाइम द्वारा सक्रिय होकर अपने विशिष्ट tRNA से जुड़ता है।
• प्रारंभन (Initiation): राइबोसोम की छोटी उपइकाई mRNA के $5'$ सिरे पर $AUG$ कोडॉन से जुड़ती है। प्रारंभिक मेथिओनाइल-tRNA P-स्थल (पेप्टिडिल स्थल) पर आता है।
• दीर्घीकरण (Elongation): अगला आवशित tRNA राइबोसोम के A-स्थल (अमीनोएसिल स्थल) पर आता है। पेप्टिडिल ट्रांसफरेज राइबोजाइम ($23S\text{ rRNA}$ प्रोकैरियोट्स में / $28S\text{ rRNA}$ यूकेरियोट्स में) पेप्टाइड बंध का निर्माण करता है। इसके पश्चात राइबोसोम एक कोडॉन आगे खिसकता है (स्थानांतरण / Translocation)।
• समापन (Termination): जब A-स्थल पर कोई स्टॉप कोडॉन ($UAA, UAG, UGA$) आता है, तो रिलीज फैक्टर (विमोचक कारक) जुड़कर पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला को मुक्त कर देता है।

फ्रांस्वा जैकब और जैक मोनोड ने E. coli में लैक्टोज के अपचय हेतु उत्तरदायी लैक ऑपेरॉन (Lac Operon) की खोज की। यह एक ऋणात्मक प्रेरक तंत्र (negative inducible operon) है जिसमें निम्नलिखित घटक होते हैं:

• नियामक जीन ($i$ जीन): यह निरंतर (सतत) रूप से लैक दमनकारी प्रोटीन (Repressor protein) को कोड करता है।
• उन्नायक ($P$ स्थल): वह डीएनए स्थल जहां आरएनए पॉलीमरेज एंजाइम बंधता है।
• प्रचालक ($O$ स्थल / Operator): ऑपरेटर पर दमनकारी प्रोटीन बंधता है।
• संरचनात्मक जीन ($lacZ, lacY, lacA$):
  • $lacZ$: $\beta$-गैलेक्टोसिडेज को कोड करता है, जो लैक्टोज को ग्लूकोज एवं गैलेक्टोज में जल-अपघटित करता है।
  • $lacY$: परमिएज (Permease) को कोड करता है, जो जीवाणु कोशिका में लैक्टोज के प्रवेश की पारगम्यता बढ़ाता है।
  • $lacA$: ट्रांसएसिटिलेज को कोड करता है, जो टॉक्सिक थायोगैलेक्टोसाइड्स का एसिटिलीकरण करता है।

1990 से 2003 तक संचालित यह 13-वर्षीय अंतर्राष्ट्रीय मेगा-प्रोजेक्ट था जिसका उद्देश्य संपूर्ण मानव जीनोम के लगभग $3 \times 10^9$ क्षार युग्मों का अनुक्रमण करना था। फ्रेडरिक सेंगर की डाईडीऑक्सी विधि द्वारा स्वचालित अनुक्रमण किया गया। HGP की मुख्य उपलब्धियां:

• मानव जीनोम में $3.1647 \times 10^9$ (लगभग 3.16 बिलियन) क्षार युग्म हैं।
• कुल अनुमानित जीनों की संख्या मात्र 20,000 से 25,000 है (पूर्व अनुमान 1 लाख से अधिक का था)।
• एक औसत जीन में लगभग 3,000 क्षारक होते हैं। सबसे बड़ा ज्ञात मानव जीन डिस्ट्रॉफिन (Dystrophin) है जिसमें $2.4$ मिलियन (24 लाख) क्षारक हैं।
• गुणसूत्र 1 पर सर्वाधिक जीन (2,968 जीन) तथा $Y$ गुणसूत्र पर सबसे कम जीन (231 जीन) उपस्थित हैं।
• सम्पूर्ण जीनोम का 2% से भी कम भाग प्रोटीनों का कूटलेखन करता है; शेष 98% भाग पुनरावृत्त डीएनए (repetitive DNA) है।
• लगभग $1.4$ मिलियन स्थानों पर एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms) पाई जाती हैं।

सर एलेक जेफ्रीस द्वारा विकसित और भारत में डॉ. लालजी सिंह एवं डॉ. वी.के. कश्यप द्वारा स्थापित यह तकनीक जीनोम में उपस्थित परिवर्ती संख्या टैंडम पुनरावृत्ति (VNTRs - Variable Number of Tandem Repeats) या मिनीसैटेलाइट बहुरूपता पर आधारित है। प्रायोगिक चरण निम्नलिखित हैं:

1. डीएनए का पृथक्करण (DNA Isolation): रक्त, वीर्य, बाल की जड़ या अस्थि मज्जा कोशिकाओं से डीएनए निष्कर्षण।
2. प्रतिबंधन पाचन (Restriction Digestion): प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज एंजाइम (जैसे EcoRI) द्वारा डीएनए को विशिष्ट स्थलों पर काटना।
3. जेल वैद्युतकणसंचलन (Agarose Gel Electrophoresis): विद्युत क्षेत्र में डीएनए के टुकड़ों को उनके आकार/लंबाई के आधार पर पृथक करना।
4. सदर्न ब्लॉटिंग (Southern Blotting): जेल पर स्थित पृथक डीएनए टुकड़ों को क्षारीय घोल से विगलित (denature) करके नायलॉन या नाइट्रोसेल्युलोज झिल्ली पर स्थानांतरित करना।
5. संकरण (Hybridization): रेडियोधर्मी $^{32}P$-लेबल वाले VNTR प्रोब के साथ झिल्ली पर संकरण कराना।
6. ऑटोरेडियोग्राफी (Autoradiography): एक्स-रे फिल्म पर अनावरण करके विशिष्ट पट्टी पैटर्न (dark bands) प्राप्त करना। प्रत्येक व्यक्ति का बैंडिंग पैटर्न (समरूप जुड़वा को छोड़कर) अद्वितीय होता है। इसका उपयोग पितृत्व विवाद, आपराधिक फोरेंसिक जांच और आप्रवासन मामलों में होता है।